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G418 Sulfate(Geneticin) 遗传霉素

简要描述:G418 Sulfate(G418硫酸盐),也称作Geneticin(遗传霉素),是一种结构类似于庆大mei素B1(Gentamycin B1)的氨基糖苷类抗生素,G418 Sulfate(Geneticin) 遗传霉素通过影响80S核糖体功能和阻断延伸步骤来干扰蛋白合成,对原核和真核等细胞都有毒性,包括细菌、酵母、高等植物和哺乳动物细胞,也包括原生动物和蠕虫。

  • 产品型号:78GA10001
  • 厂商性质:经销商
  • 更新时间:2024-07-17
  • 访  问  量:2006

详细介绍

品牌BIOHUB供货周期两周
应用领域生物产业

G418 Sulfate(Geneticin) 遗传霉素

基本信息CAS号  108321-42-2

分子式  C20H40N4O10·2 H2SO4

分子量  692.7 g/mol

外观  白色粉末

纯度  ~98%

活力溶解性  >700 μg/mg 溶于水

产品简介

       G418 Sulfate(G418硫酸盐),也称作Geneticin(遗传霉素),是一种结构类似于庆大mei素B1(Gentamycin B1)的氨基糖苷类抗生素,G418 Sulfate(Geneticin) 遗传霉素通过影响80S核糖体功能和阻断延伸步骤来干扰蛋白合成,对原核和真核等细胞都有毒性,包括细菌、酵母、高等植物和哺乳动物细胞,也包括原生动物和蠕虫。其抗性基因(主要为neo基因)位于转座子Tn601(903)或Tn5(来源于细菌),但是可以在真核细胞中表达。通过基因重组技术将这些抗性基因导入细胞,使其获得对G418的耐药性,从而用来筛选和维持培养携带抗性基因的原核或者真核细胞。 哺乳动物细胞中,当抗性基因neo被整合进真核细胞基因组后,使其编码表达氨基糖苷磷酸转移酶(amino-glycoside 3’-phosphotransferase,APH(3')II)。此酶通过共价修饰G418的氨基或羟基功能,抑制抗生素-核糖体间的相互作用,从而使得抗生素失活。这一特性赋予细胞产生抗性。稳转细胞株筛选实验,需要建立杀灭曲线(剂量反应曲线)确定杀死无抗性细胞的zui低有效浓度。 植物细胞中,通过转染携带nptII基因的抗性质粒孵育其抗性。nptII基因也能编码表达氨基糖苷磷酸转移酶,这个酶使得多种抗生素丧失活性,包括G418,卡那mei素和巴龙mei素。

使用说明

1. G418储存液的配制(50 mg/mL,活性浓度)

   (1)活力单位的换算

根据此公式进行换算:(1000/A0)×A1=A2,其中A0是G418的活力值(Potency),因批次而异。可见批次对应的质检报告,或者瓶子上的标签。A1是想配制的活性G418浓度。A2是实际称重的粉末与体积比浓度。

比如若所用批次的G418 活力值为:750 µg/mg,要配制50 mg/mL的G418活性浓度,则实际要配制的粉末浓度为1000/750×50 mg/mL=66.33 mg/mL。

如果配制10 mL的G418储存液(活性浓度,50 mg/mL),则需要称取663.3 mg粉末。

(2)除菌和保存

根据上述换算得到的实际粉末称重量,加入10 mL无菌去离子水内使其wan全溶解。

先用5 mL无菌去离子水预湿润0.22 μm针头式过滤器,除尽水。之后使用此滤器过滤,除菌后分装成单次使用的小量(如1mL)放到-20℃冻存,1年稳定。

【注】

     ①不要对混浊的溶液进行过滤,因为混浊的溶液意味着未wan全溶解,过滤过程中会造成药物损失,降低终液的活性。

     ②不建议使用液体培养基,NaCl,磷酸盐溶液或者有机溶剂来制备储存液。

 

2. 常用筛选浓度

一般来说,刚开始筛选转化子需要高浓度的G418,并用一个较低浓度的G418用于维持培养。生长条件,细胞类型和其他的环境因素都可能影响G418的用量,因此第一次使用的实验体系建议通过杀灭曲线(kill curve),即剂量反应性曲线,来确定最佳筛选浓度。

通常情况,哺乳动物细胞筛选范围200-2000 μg/mL;植物细胞:10-100 μg/mL;酵母细胞:500-1000 μg/mL。

以下是一些细胞类型使用G418筛选使用的浓度,可做参考。

细胞类型

激活浓度

应用

网柄菌属

a) 10 μg/mL

b) 30 μg/mL

a)培养在培养液中

b)培养在冻干细菌上

哺乳动物

a) 400 -1000 μg/mL

b) 200 μg/mL

a)用于筛选

b)用于维持生长

植物

a) 25-50 μg/mL

b) 10 μg/mL

a)用于筛选

b)用于维持生长

酵母

a) 500 μg/mL

b) 125-200 μg/mL

a)用于筛选

b)用于维持生长

细菌

16 μg/mL

用于筛选


3.
杀灭曲线的建立

 【注意事项】为了筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞株,需要确定能够杀死未转染宿主细胞的抗生素zui低浓度,可通过建立杀灭曲线来实现,至少选择6个浓度。处理分裂期的细胞时G418的活性zui强,因此在添加G418之前需要让细胞培养一段时间。

(1)第一天:未转化的细胞按照20-25%的细胞密度铺在合适的培养板上,37℃,CO2培养过夜。

     【注】对于需要更高密度来检测活力的细胞,可增加接种量。

(2)根据细胞类型,设定合适范围内的浓度梯度。以哺乳动物细胞为例,可设定0,50,100,200,400,800,1000 μg/mL。

(3)第二天:去除旧的培养基,换用新鲜配制的含有相应浓度药物的培养基。每个浓度做三个平行孔。

(4)接下来每3-4天更换新的含药物培养基。

(5)按照固定的周期(如每2天)进行活细胞计数来确定阻止未转染细胞生长的恰当浓度。选择在理想的天数(通常是7-10天)内能够杀死绝大多数细胞的zui低浓度为稳定转染细胞筛选用的工作浓度。

 

4. 稳定转染细胞的筛选

      (1)转染48 h后,用含有适当浓度的G418筛选培养基来传代细胞(直接传代或者稀释后传代)。

    【注】细胞处于活跃分裂状态时抗生素的杀伤效果好。当细胞过于稠密,其效率会降低。为了得到较好的筛选效果,请最好将细胞稀释至丰度不超过25%。

(2)每隔3-4天更换含有药物的筛选培养液。

(3)筛选7天后观察并评估细胞克隆(集落)的形成情况。集落的形成可能还需要一周或者更多的时间,这取决于宿主细胞类型,转染以及筛选效果。

(4)挑取并转移5-10个抗性克隆于35 mm细胞培养板,继续用含药物的筛选培养液维持培养7天。

(5)之后更换正常培养基培养即可。

运输与保存方法

常温运输。-20℃避光保存,有效期3年。避免受潮,否则会降低抗生素活力。

注意事项

(1)本品不可高压灭菌;

(2)G418不要和其他的抗生素/抗真菌剂(如青mei素/链mei素)共同使用,因为它们是G418的竞争性抑制剂。其他的抗生素也会产生交叉活性。

(3)配制G418溶液时,一定要根据G418批次不同的活力值(potency)来进行换算,从而得到需要活性浓度的储存液及工作液。

(4)G418加入培养体系中未转染的细胞有可能不会被杀死,原因在于药物浓度过低,或者细胞密度过高。另外,快速分裂的细胞相对于缓慢增殖细胞,更容易被杀死。对照细胞(未转染)可能抗生素添加5-7天后才能杀死,转染细胞(抗性克隆子)的克隆需要10-14天形成。

(5)即使加入杀死剂量的G418,细胞可能会继续分裂2-3次。G418的药效通常在2天后才变得明显。

(6)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

 

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