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聚乙烯亚胺PEI-Pro(GMP)

简要描述:BIOHUB Polyethyleneimine PEI PRO(GMP)是GMP级别转染试剂。

  • 产品型号:78EF10003
  • 厂商性质:经销商
  • 更新时间:2023-11-30
  • 访  问  量:1280

详细介绍

品牌BIOHUB供货周期两周
应用领域生物产业

BIOHUB Polyethyleneimine PEI PRO(GMP)是GMP级别转染试剂,本制品利用BIOHUB公司生产的线性阳离子聚合物,按照符合GMP认证管理体系下,采用药用规格原辅料生产,所用起始材料及所需化学品和配制过程均在无菌环境中操作进行,以确保制造过程中每个步骤的特性、效力、纯度和安全性的一致性 并严格控制重金属残留、细菌内毒素残留等,生产工艺符合 GMP 规范的产品生产与质量管理规程,保障生产过程及所有原辅料可追溯。

  • PH值检测通过中国药典 2020 版第四部 pH 值测定法(通则 0631)

  • 检测遵循《人用基因治疗总论-中国药典 2020》国家药典委。

  • 检测遵循USP Chapter <1043>, Ancillary Materials for Cell, Gene, and Tissue-Engineered Products 用于细胞治疗,基因治疗和组织工程产品中的辅料。

  • 细菌内毒素检测符合中国药典2015版四部通则(1143)方法2光度测试法(动态浊度法)

  • 重金属残留检测符合国药典 2020 版第四部重金属检查法(通则 0821)

  • 支原体检测 使用支原体检测试剂盒

质量信息表

 

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产品特点
        BIOHUB-PRO GMP在 HEK293和CHO大多数表达系统中,BIOHUB-PRO GMP 都能提供稳定的高表 达(96 孔板至 100L 生物反应器)。现在每年有更多的研究人员和公司选择使用 BIOHUB-PRO GMP 进行细胞转染.。
  • GMP级别定制监管,支持并满足合规要求。

  • 不含动物源性成分。

  • 严格遵循以下规范生产 1. ISO 9001:2015, certified facility。

  • 严格按照《GMP 附录-细胞治疗产品》国家药品监督管理局。

  • 从工艺开发到临床试验和商业化的无缝过渡生产细胞系(HEK-293 和衍生物、VERO 等的最高病毒产量。

操作方法参考

 

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 一、贴壁细胞转染 以 6 孔板转染 293T 细胞为例:(一)转染前准备1) 转染前一天:用胶原酶 I型(78CL10002)消化细胞并计数(不建议用yi酶)。 按照每孔2×10 6的细胞量接种293T 至 6 孔板(每孔加入 2ml 新鲜的 DMEM:F12+5�S wan全培养基和 1ml 的细胞悬液)置于 37°C,5%CO2培养 箱培养 24h。2) 24h 后,移除之前培养基,每孔加入 2ml 新鲜的 DMEM:F12+5�S。注意:确保 293T 细胞生长状态良好传代 不超过 15 代。(二)转染过程3) 第一天:显微镜下检查细胞汇合度, 当细胞达到 70%到 80%的汇合度时,开始准备转染。4) 对于每孔细胞,用 100µl 无血清培养基(如 OPTI-MEMⅠ培养基)稀释 DNA 使 DNA 终浓 度为 1ug/ml(DNA/总培养体积)。5) 对于每孔细胞,用 100μL 无血清培养基(如 OPTI-MEMⅠ培养基)稀释适当比例的适量 BIOHUB-PRO GMP 。DNA:BIOHUB-PRO GMP  的比例要依据自己实验摸索最适比例。6) 将稀释的 BIOHUB-PRO  GMP转染试剂加入到稀释的质粒中(总体积 200µL)轻轻混匀, 室温孵育 30 分钟。7) 小心地将 BIOHUB-PRO  GMP复合物滴加到细胞培养板每个孔中,轻轻摇动培养板混匀。注 意加入混合液时轻轻沿着孔板边缘滴入,而不是在细胞的顶部以免破坏细胞的粘附性。8) 将培养板放入 37°C,5%CO2培养箱培养中培养 24h。(三)观察转染结果 9) 第二天:在荧光显微镜下观察细胞转染效率,通常超过 80%的 293T 细胞在转染后的 24h 可以观察到绿色荧光。 小贴士 :建议进行不同基因转染时应对 BIOHUB-PRO GMP 和 DNA 的比例进行优化,以达到最适比例, 通常筛选范围在 1:1 到 1:3 之间。如果之前用过进口品牌的 PEI,用BIOHUB-PRO  GMP时应适当 降低使用浓度。      通常情况下,分别准备BIOHUB-PRO GMP  GMP和 DNA 转染溶液时其体积一般是转染前每孔细胞培 养液体积总量的 1/10-1/20,如细胞培养液体积为 3ml,则稀释BIOHUB-PRO  GMPI及 DNA 的体积为150ul。质粒 DNA 的浓度通常为 1ug/ml(DNA 质量/细胞培养总体积)[1][4]。 不同质粒种类以及大小会影响转染效率,如较大片段插入质粒可能转染效率低,可根据 实际实验需要调整,如适当增加转染质粒总量等。 HEK293 GnTI 细胞重悬浮可用枪头或移液管反复吹打,但 CHO-S 细胞的粘附性比较强 重悬浮时需要借助细胞刮刀。 一般建议用胶原酶消化细胞,如果表达的是膜蛋白,yi酶消化细胞可能会降低蛋白表达, 建议用胶原酶消化细胞,我们推荐用(78CL10002)的胶原酶。 对于贴壁性低的细胞系,可用明胶或鼠尾胶铺板,增加细胞与培养皿之间的粘附性。 一旦确定了细胞类型、培养基和78BioPEI GMP与 DNA 的最佳比例,就可以在转染后 24 至 96 小时内多次观察转染效率,以优化最大表达量时间点。二、悬浮细胞转染 离心对数期生长的细胞用新鲜的培养基重悬浮使细胞密度达到 1×10 6cells/mL 小规模转 染时,如需大规模转染细胞密度要到达 2-3×10 6cellsml/mL。以 293F 细胞 于 100mL 培养瓶(溶液体积占瓶体积的 1/5)操作体系举例如下:(一)转染前准备 1) HEK293F 细胞传代接种于 20mL 悬浮细胞生长培养基中(36.5℃,120rpm,5%CO2 )的条 件下培养。当细胞密度到 1X10 6cells/mL,然后旋紧瓶口放入摇床继续培养,2~4 小时 后可以进行转染。(二)转染过程 2) 用 1mlOptiPRO™SFM(无血清培养基)稀释适量的 DNA,使 DNA 终浓度为 1ug/ml(DNA/总 培养体积)。混匀并静置 5min。 3) 用1mlOptiPRO™SFM(无血清培养基)稀释适当比例的BIOHUB-PRO  GMP,混匀并静置 10min。(78BioPEI:DNA 参考比例范围,可参考上述贴壁细胞BIOHUB-PRO  GMP和 DNA 优化方案优化)。 4) 将BIOHUB-PRO  GMP转染试剂加入到稀释的质粒中轻轻混匀,室温孵育 30 分钟。 5) 将BIOHUB-PRO  GMP转染复合物逐滴加入到细胞培养液中,摇匀后旋紧瓶口放回摇床 (36.5℃,5%CO2,120rpm)。 6) 基因表达可在 24-72 小时后检测,具体时间取决于细胞系和转基因. 小贴士:在悬浮培养中,单个细胞的转染效率要高于聚集在一起的细胞,需要优化适合单细胞的 生长条件。方形瓶应经过两个连续的干燥循环高压灭菌(每个 45 分钟,干燥 15 分钟) 盖子应尽可能松,不得脱落。应该让它们冷却拧紧盖子前,将其wan全放入层流罩中。如果瓶子向内塌陷,细胞将无法正常生长。 如果要获得更多的蛋白产量,有参考文献表明转染后 24 小时,可以适当稀释细胞,稀 释比例参考范围(1:2—1:5)之间,可以增加蛋白产量,稀释效应与最佳稀释比率应根 据经验确定, 可以把 DNA 和BIOHUB-PRO  GMP 转染试剂直接加入到细胞悬液中进行转染,但必须经过上述 特定流程的 DNA 和转染试剂的比例和用量的相应优化。

注意事项

  1. 不同质粒种类以及大小会影响转染效率,可如较大片段插入质粒可能转染效率低,可根据实际实验需要调整,如适当增加转染质粒总量等。

  2. 细胞状态及代数会较大程度影响转染。刚复苏细胞需传代2-3次以上,待细胞生长稳定后做转染实验。为保证实验稳定性,转染细胞尽量选择20代以内进行实验。

  3. 对于贴壁性低的细胞系,可用明胶或鼠尾胶铺板,增加细胞与培养皿之间的粘附性。

  4. 初次使用应优化DNA浓度和 BIOHUB-PRO GMP试剂量以得到最大的转染效率。 DNA 和转染试剂的比例, 通常推荐是1:2-1:3,通过调整DNA/BIOHUB-PRO  GMP转染试剂比例优化转染效率,调整范围DNAμg:BIOHUB-PRO  GMP(μL) 比值在1:0.5-1:5

  5.  为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作

 

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