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手把手教你做出RT-qPCR最美曲线系列:如何正确选择逆转录引物?

更新时间:2023-08-24      点击次数:164


1. Oligo(dT)


Oligo(dT)是多聚胸腺嘧啶、T重复寡核苷酸,就是只有胸腺嘧啶组成的核苷酸链。因为Oligo(dT)与mRNA的Poly(A)尾巴可以发生特异性结合,所以用Oligo(dT)特异结合到mRNA上Poly(A)尾端,因此,主要用于逆转带有Poly(A)尾的mRNA。例如模板为真核生物来源,Oligo(dT)可与mRNA的3’Poly(A)尾配对,有利于长链或全长mRNA的逆转录。但是,其对RNA样品的质量要求较高,不允许其降解,否则全长cDNA合成量会大量减少。

2. 随机引物

随机引物是指当特定mRNA由于含有使逆转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时,可采用随机六聚体这一不特异的引物来拷贝全长mRNA,一般6到8个碱基,许多随机引物组成一套引物组。它可用于mRNA、rRNA、tRNA等各种RNA的逆转录,对于目标区域具有复杂二级结构/GC含量较高,或者来源为原核生物的模板也同样适应。

3. 基因特异性引物

基因特异性引物(GSP)是某个基因序列的一部分,与模板互补的引物。该引物需要结合目标RNA的已知序列进行设计的。由于引物和RNA序列特异性结合,每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。因此,当分析多种目标时,则需要适用更多的RNA样本。通常特异性引物用于一步RT-qPCR实验中。


 


PART 02

逆转录引物优劣势比较


 

引物类型

结合部位

优点

缺点

Oligo(dT)

真核生物mRNA3’端poly(A)尾

可合成全长cDNA

1、仅扩增有polyA尾的mRNA

2、对模板质量要求高

随机引物

RNA的许多随机可结合部位

适合复杂结构和微量模板

特异性低,小片段多

基因特异性引物

特异性互补序列

特异性强,灵敏度高

仅合成特定的序列




PART 03

逆转录引物的选择

RNA类型:

1、真核生物mRNA

2、miRNA、核糖体RNA和tRNA等小RNA前体加A尾处理后的模板

引物选择:

Oligo(dT)

原因:

1、真核生物mRNA含有poly(A)尾,可以Oligo(dT)引物结合

2、miRNA、rRNA和tRNA本身无A尾,故需要人工处理后才能与Oligo(dT)引物结合

 

RNA类型:

1、rRNA、tRNA、原核生物mRNA等无3’端poly(A)尾的模板

2、长度比较长、有二级结构存在及微量样本的模板

引物选择:

随机引物

原因:

随机引物可以在任意位点和RNA结合并开始反转

 

RNA类型:

1、已知基因序列的模板

2、miRNA增加茎环结构的模板

引物选择:

基因特异性引物

原因:

1、针对特定序列设计的反转录引物

2、miRNA(茎环法)的反转录,需要根据基因序列设计对应的引物

 

:为提高反转录效率,并保障获得更加完整的cDNA,建议将Oligo(dT)和随机引物混合使用。

 

PART 04

精品推荐


 

RNA类型

引物选择

原因

1、真核生物mRNA

2、miRNA、核糖体RNA和tRNA等小RNA前体加A尾处理后的模板

Oligo(dT)

1、真核生物mRNA含有poly(A)尾,可以Oligo(dT)引物结合

2、miRNA、rRNA和tRNA本身无A尾,故需要人工处理后才能与Oligo(dT)引物结合

1、rRNA、tRNA、原核生物mRNA等无3’端poly(A)尾的模板

2、长度比较长、有二级结构存在及微量样本的模板

随机引物

随机引物可以在任意位点和RNA结合并开始反转。

1、已知基因序列的模板

2、miRNA增加茎环结构的模板

基因特异性引物

1、针对特定序列设计的反转录引物

2、miRNA(茎环法)的反转录,需要根据基因序列设计对应的引物






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