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488 Caspase-3活细胞分析试剂盒说明书

更新时间:2023-10-24      点击次数:90

488 Caspase-3活细胞分析试剂盒说明书

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产品描述

活细胞分析试剂盒包含 488 Caspase-3底物和Ac-DEVD-CHO Caspase-3/7抑制剂。 488 Caspase-3 Substrate为基于Caspase-3/7活力检测细胞凋亡提供了有效的工具,适用于荧光显微观察和流式细胞仪分析。

相较于其它基于(FLICA)分析的 Caspase 的荧光底物或荧光抑制,试剂盒内提供的Substrate 检测Caspase-3/7 活性的同时不会抑制完整细胞的凋亡过程。Substrate由耦合Caspase-3/7 DEVD识别序列的荧光DNA染料组成。Substrate 最初无荧光,其会穿过细胞膜进入细胞质。在凋亡细胞中Caspase-3/7剪切Substrate释放高亲和性的DNA 染料,这种染料迁移到细胞核标记DNA 并发出明亮的绿色荧光。Substrate 是双功能的,既可以检测 Caspase-3/7 活性,又能可视化细胞核在细胞凋亡进行中的形态学变化。

使用方法
使用方法

1. 实验优化
下面提供的实验步骤根据终点法检测制度。488 Substrate 可进行细胞长时间孵育过程研究。细胞密度、底物浓度和抑制剂浓度可能需要优化。推荐底物浓度1-10 μM之间。细胞可在培养基、PBS或其他的缓冲液中孵育底物。对于贴壁细胞,建议更换新鲜含有底物的培养基,以防背景的不均一性。底物孵育后换液或洗涤细胞等操作可自由选择。
2. 对照设定

推荐设定以下对照:

A. 阴性对照:不诱导凋亡的细胞

B. 阳性对照:诱导凋亡的细胞

C. 抑制剂对照:诱导细胞凋亡同时(或提qian10-30 min)孵育Caspase-3/7抑制剂,最后再添加 488 Caspase-3底物。

3.  抑制剂对照

试剂盒中所提供的Caspase-3/7 抑制剂 Ac-DEVD-CHO 可用来确认Caspase-3/7 依赖于 488 的荧光信号。对于抑制剂对照,抑制剂的终浓度应至少是底物浓度的2倍(例如当使用5 μM 488 底物时,Ac-DEVD-CHO浓度为 10 μM)。添加底物前在室温下孵育Ac-DEVD-CHO 15-30 min,加入底物后,孵育液中继续保留抑制剂。Ac-DEVD-CHO 是可逆的竞争性抑制剂。对于某些细胞类型有效的Caspase-3/7 抑制剂需要使用不可逆的抑制剂,如Z-DEVD-FMK,或需要在凋亡诱导之前或诱导过程中添加抑制剂。

4. 流式细胞仪分析

4.1 选择合适的方法诱导细胞凋亡,未经处理的细胞样本作为对照。

4.2 对于贴壁细胞,实验前先用胰蛋白酶或其他方法消化细胞。

4.3 用细胞培养基或合适缓冲液重悬细胞,使细胞密度达到106/mL数量级。

4.4 添加200 μL 细胞悬液至流式细胞试管。

4.5 抑制剂对照样本,用Ac-DEVD-CHO 处理细胞(见上文)。

4.6 200 μL细胞悬液中加5 μL 0.2 mM 的Substrate并立即混匀使底物浓度为5 μM。不同类型细胞最佳底物浓度可能不同,需进一步优化。

4.7 室温避光孵育15-30 min。

4.8 加入300 μL细胞培养基或PBS,使用流式细胞仪分析,选择检测绿色荧光的通道(激发/发射:485/515 nm)。

5. 荧光显微镜观察

5.1 选择合适的方法诱导细胞凋亡,未经处理的细胞样本作为对照。

5.2 抑制剂对照样本,用Ac-DEVD-CHO 处理细胞(见上文)。

5.3 用含5 μM Substrate 的新鲜培养基或PBS对细胞进行换液(见试验优化)。对于抑制剂对照组,抑制剂与底物一同孵育。

5.4 室温孵育30 min 或更长时间。

5.5 PBS或其它缓存液清洗细胞,荧光显微镜观察细胞,使用观察绿色荧光的滤片(激发/发射:485/515 nm)。

6. 荧光酶标仪检测

6.1 将贴壁细胞生长在黑色96孔板中;对于悬浮细胞,调整密度至106/mL,每孔加入0.2 mL细胞悬液。

6.2 选择合适的方法诱导细胞凋亡,未经处理的细胞样本作为对照。(注意:细胞可能在管或瓶中处理,然后转移到 96孔检测板。)

6.3 抑制剂对照样本,用 Ac-DEVD-CHO 处理细胞(见上文)。

6.4 对于悬浮细胞,直接添加Substrate 混匀。对于贴壁细胞,用含有5 μM Substrate的新鲜培养基或PBS对细胞进行换液(见试验优化)。对于抑制剂对照组,抑制剂与底物一同孵育。

6.5 细胞可以在含有Substrate 的培养基中直接观察。

6.6 对于悬浮细胞,轻轻震荡重悬细胞。荧光酶标仪设置激发波长488 nm和发射波长520 nm。建议贴壁细胞使用底部阅读方式。贴壁细胞密度的变化可能导致不准确的读数。

运输及保存方法

冰袋(wet ice)运输。储存于4ºC,至少可以储存12个月。
注意事项

1、细胞可用Hoechst 33342 染料(推荐浓度1 μM)共染,使细胞核产生蓝色荧光染色(Ex/Em=346/460 nm)。

2、488 染料可用甲醛固定,但与甲醇固定不兼容。

3、经甲醛固定的488染色细胞可用0.1% TritonX-100处理后行后续染色,但这样处理后的染色亮度可能会减弱。

4、操作时请采取防护措施,穿防护服、戴一次性手套等。
5、本产品仅作科研用途!

货号品名规格品牌
78DC10160-25T488 Caspase-3活细胞分析试剂盒25TBIOHUB
78DC10160-100T488 Caspase-3活细胞分析试剂盒100TBIOHUB





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