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Alamar Blue 阿尔玛蓝细胞增殖及毒性检测试剂说明书

更新时间:2023-10-24      点击次数:158

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产品描述

  阿尔玛蓝(Alamar Blue)是一种细胞活力检测试剂,包含一种具细胞膜渗透性、无毒性且弱蓝色荧光的指示剂,即刃天青 (resazurin)。自从1993年开始刃天青就作为一种值得信赖和可靠的试剂被引用。阿尔玛蓝是MTT(噻唑兰)的有效且无毒 替代物。阿尔玛蓝能定量检测人、哺乳动物、细菌、真菌和支原体细胞的增殖情况,也能用于细胞因子生物活性、细胞活力分 析、体外细胞毒性确定以及细胞生长监测。


工作原理

刃天青(resazurin)是一种氧化还原(REDOX)指示剂,根据细胞代谢还原情况发生颜色变化。氧化态的刃天青呈紫蓝色且基本无荧光,其还原态产物试卤灵(resorufin)转变为粉红色且高度荧光,产生的荧光强度与呼吸活细胞数量呈正比。通过检测 ,呼吸过程中氧化水平,阿尔玛蓝用作一种定量检测细胞活力和毒性的直接指示剂。阿尔玛蓝的颜色变化可通过普通分光光度计 检测吸光度变化,检测波长为570nm,参考波长为600nm;阿尔玛蓝的荧光变化可通过荧光光度计检测,激发波长在 530~560nm之间,发射波长为590nm


操作说明

一、制作标准曲线(测定最佳孵育时间和细胞数量)

1. 每孔加入100微升细胞悬液(对数生长期细胞),对细胞计数。按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度,一般要做3-5个细胞浓度梯度,每个浓度建议3-6个复孔。注:设置阴性对照:细胞培养基中不加入细胞;阳性对照:100微升100%还原型Alamar Blue(不含细胞)。

2. 每孔加入10微升Alamar Blue,阳性对照孔中加入10微升无菌的超纯水。

3. 放入细胞培养箱内培养(37,5% CO2)一定时间,培养基的颜色由靛青蓝开始变成粉红色就可以进入下一步。

4. 推荐用荧光分光光度计检测,激发光波长在530-560 nm之间,发射光波长为590 nm

5. 普通分光光度计在570nm测定吸光度,参考波长600nm。也可用570/630 nm540/600 nm替代。

6. 绘制标准曲线。以细胞数量或孵育时间为横坐标(X轴),Alamar Blue还原率为纵坐标(Y轴)。根据此标准曲线可以测定出适合的细胞数量或孵育时间(使用此标准曲线的前提是实验的条件要一致)。

a)公式 1:通过吸光值来计算还原率

Alamar Blue 还原率(%)=[E600×A570-E570×A600]/[(E570′×C600)-E600′×C570] ×100

E600=氧化态 Alamar Blue 600nm 波长的消光系数;

E570=氧化型 Alamar Blue 570nm 波长的消光系数;

A600=检测孔在 600nm 波长的吸光值;

A570=检测孔在 570nm 波长的吸光值;

E570=还原态 Alamar Blue 570nm 波长的消光系数;

E600=还原态 Alamar Blue 600nm 波长的消光系数;

C570=阴性对照孔在 570nm 波长的吸光值(不加细胞的培养基+Alamar Blue);

C600=阴性对照孔在 600nm 波长的吸光值(不加细胞的培养基+Alamar Blue);

b)公式 2:通过荧光值来计算还原率

Alamar Blue 还原率(%)=(实验组 FI 590-阴性对照组 FI 590)/(100%还原态 Alamar Blue 阳性对照 FI 590-阴性对照组 FI 590)×100

FI 590=590nm 发射波长(560nm 激发波长)下的荧光强度;

6. 绘制在每个特定细胞密度或孵育时间 Alamar Blue 的还原率。

a)对确定最佳细胞密度的实验,以细胞密度的对数(log)为 x 坐标,Alamar Blue 还原率为纵坐标;

b)对确定最佳孵育时间的实验,以孵育时间为 x 坐标,Alamar Blue 还原率为纵坐标;

c)根据以上曲线图来确定最佳细胞密度或孵育时间。

二、细胞毒性和细胞增殖检测

1. 每孔加入100微升细胞悬液(对数生长期细胞),对细胞计数。建议细胞数量为104/ml,具体每孔需要的细胞数量,需根据细胞类型决定。

2. 细胞中加入待检测药物,为检测药物对细胞增殖的作用,请设置合适的对照组,包括刺激细胞和非刺激细胞。

3. 混匀,放入细胞培养箱内孵育(37,5% CO2)一段时间。

4. 每孔加入10微升Alamar Blue。阳性对照孔中加入10微升无菌的超纯水。

5. 放入细胞培养箱内孵育(37,5% CO24-8h,最佳孵育时间取决于细胞类型。培养基的颜色由靛青蓝开始变成粉红色就可以进入下一步。

6. 推荐用荧光分光光度计检测,激发光波长在530-560 nm之间,发射光波长为590 nm

7. 普通分光光度计在570nm测定吸光度,参考波长600nm。也可用570/630 nm540/600 nm替代。

a)公式 3:通过吸光值来计算还原度的变化百分比

Alamar Blue 还原度变化百分比(%)=[(E600×A570)-(E570×A600)]/[( E600×P570)-(E570×P600)] ×100

E600=氧化态 Alamar Blue 在 600nm 波长的消光系数;

E570=氧化态 Alamar Blue 在 570nm 波长的消光系数;

A600=检测孔在 600nm 波长的吸光值;

A570=检测孔在 570nm 波长的吸光值;

P570=阳性对照孔在 570nm 波长的吸光值(不含待测药物的细胞+ Alamar Blue)

P600=阳性对照孔在 600nm 波长的吸光值(不含待测药物的细胞+ Alamar Blue)

结果判断:假如 Alamar Blue 还原度变化百分比(%)=62%,说明相对于对照孔,检测孔 Alamar Blue 的还原变化值为 62%,换句话而言,相对于对照孔,38%的检测孔细胞生长受到抑制。

b)公式 4:通过荧光值来计算还原度的变化百分比

Alamar Blue 还原度变化百分比(%)=(实验组 FI 590/阴性对照组 FI 590×100 FI 590=590nm 发射波长(560nm 激发波长)下的荧光强度;

结果判断:假如 Alamar Blue 还原度变化百分比(%)=25%,说明相对于对照孔,检测孔 Alamar Blue 还原变化值为 25%,换句话而言,相对于对照孔,75%的检测孔细胞生长受到抑制。



运输与保存方法

保存:4℃避光保存,至少一年有效。运输:冰袋运输。



注意事项

1) 还原态的 Alamar Blue 在水或水溶性缓冲液如 PBS 中很不稳定,但在培养基内非常稳定。为了确定特定实验还原态 Alamar Blue 的吸光度/荧光值,需准备 100%还原态 Alamar Blue 试剂:将 Alamar Blue与细胞培养基(含血清)按照 1:10 的比例混合,121℃高压灭菌 15min 即可。由于荧光值定义比较随意,仪器不同荧光值都可能发生变化,因此,测定 100%还原态 Alamar Blue 荧光值时必须要和样本测定使用相同的仪器和培养基。


2) 适宜的细胞密度能够增加检测灵敏度。对于 96 孔板,建议每孔接种 100μl 细胞,细胞浓度范围:贴壁细胞为 100-10,000 /孔,悬浮细胞在 2,000-50,000 /孔,以培养基为空白对照。对于 384 孔板,细胞浓度和接种量均减半。


3) 影响细胞对 Alamar Blue 反应的两大变量为孵育时间和铺板密度,建议实验前需先摸索优化这两个因素。细胞密度过高或孵育时间过长都会导致继发性还原反应,红色产物停止增加并开始衰减,导致吸光度/荧光水平明显下跌并伴随红色消失。


4) 微生物污染会还原 Alamar Blue。因此对被污染细胞使用 Alamar Blue 检测会引起错误结果。


5 Alamar Blue 可以用分光光度计或荧光计检测,但荧光灵敏度高,实验误差小,推荐荧光检测。


6) 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。


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